細 胞 培 養 技 術

                       
                      細胞培養發展史及其應用
                       
                      (一)前言
                       
                      20世紀初,人們不知道神經纖維是由神經細胞的細胞質向外突出形成的,還是由神經細胞周圍的其他細胞融合而成的。生物學家們就這個問題展開了激烈的爭論。1907年,美G生物學家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經組織,把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養。蝌蚪的神經組織存活了好幾周,并且從神經細胞中長出了神經纖維。哈里森的實驗不僅解決了神經纖維的起源問題,而且開創了動物組織培養的先河。此后,在許多科學家的不懈努力下,動物組織培養不斷改進并逐漸發展成為動物細胞培養。
                      所謂動物細胞培養(亦稱組織培養)既有別于植物細胞培養,又與微生物的培養完全不同。所謂動物細胞培養是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖過程,在此過程中細胞不再形成組織。
                      由于動物細胞培養是在人工條件下進行的,便于調控和觀察,因而成為現今研究動物的物質代謝過程、染色體的形態變化、以及遺傳物質的表達調控等高難*域的既便利而又有效的新方法。同時,隨著現代生物化學、分子生物學、分子遺傳學、以及現代醫學的發展,細胞培養也在許多應用*域充分展示了其巨大的發展潛力,并已為世人所關注。盡管如此,動物細胞培養仍是一門年輕的新學科,在發展之初被混淆于動物組織培養之中。
                       
                      (二)細胞培養技術及其歷史
                       
                      細胞培養的歷史**早可追溯到19 世紀末,據可考證的資料記載Wilhelm Roux是**個進行動物組織培養實驗的人。
                      1885年Wilhelm Roux 將雞胚髓板放置于溫熱鹽水中使之維持存活了數天,是有記錄的**個體外移植成功的例子。
                      1887年Arnold把愷木的木髓碎片接種到蛙的身上。當白細胞侵入這些木髓碎片后,他把這些白細胞收集在盛將鹽水的小碟中,接下來觀察到這些白細胞在運動,并存活了一個短的時間。
                          1903年,Jolly將蠑螈的白細胞保存在懸滴并維持了十個月。
                          1906年,Beebe和Ewing在動物的血液中嘗試培養了傳染性巴肉瘤的細胞。
                      可是,由于當時的培養基并不理想,因此實驗難以重復,并且也難以證明這些先軀者所培養的是否是真正存活的健康的組織和細胞。結果都和Welhelm ,一樣只能維持離體細胞的短期存活,而沒有細胞的生長和增殖。
                      直到1907年,美G胚胎學家Ross Harrison的實驗才被公認為組織培養真正開始的標志,因為該實驗但提供了可重復的技術,而且證明了生物組織的功能可以在體外十分明確地延續下去。Ross Harrison將蛙胚神經管區的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中,這片組織在體外不但存活了若干星期,而且居然還從細胞中長出了軸突(神經纖維), 解決了當時關于軸突起源的爭論,并表明了利用體外存活的組織進行實驗研究的可能性。他所采用的把培養物放在蓋玻分上并倒置于凹玻片腔中的方法還一直沿用**今,稱為蓋片復蓋凹窩玻璃懸滴培養法 。
                      在此基礎上,1912年Carrel 則更加豐富和完善了此項技術,他將無菌操作技術引入動物細胞培養,在沒有使用抗菌素的條件下使雞胚心臟細胞在人工培養條件下生存了34年,并且先后傳代3400次。并發現動物體液中存在著對動物細胞生長有強烈促進作用的生長因子。這一結論早已被現在的研究所證實,并成為無血清培養基研究的基礎。由于這兩個人的**成就,細胞培養從此開始了迅猛的發展,并成為生物工程特別是細胞工程中一項重要的基礎技術.
                      1912年,當時的Carrel是外科醫生,在實驗中特別注意無菌操作。他用血漿包埋組織塊外加胎汁的培養法,并采用了更新培養基和分離組織的傳代措施,從而完善了經典的懸滴培養法(Suspension Culture)。Carrel用這種方法,曾培養一雞胚心肌組織長達數年之久。這些創造性的工作充分揭示:離體的動物組織在培養條件下,具有近于無限的生長和繁殖能力;并充分證明組織培養的確是研究活組織和細胞的極好方法。
                      1924年Maximow又把Carrel的懸滴培養法改良為雙蓋片培養,使之更易于傳代和減少污染。Carrel又設計了用卡氏瓶培養法,擴大了組織的生存空間。自懸滴培養問世后的30年中,以Harrlson和Carrel為shou的科學家們,用這些方法對各種組織在體外生長的規律和細胞形態進行了深入的研究,發表了大量論文,為組織培養的進一步發展奠定了鞏固的基礎。
                       
                      (三)動物細胞的培養方法
                       
                      (1)貼壁培養法
                      大多數動物細胞在離體培養條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長,并**終在附著表面擴展成單層。其基本操作過程是:先將采集到的活體動物組織在無菌條件下采用物理(機械分散法) 或化學(酶消化法) 的方法分散成細胞懸液,經過濾、離心、純化、漂洗后接種到加有適宜培養液的培養皿(瓶、板) 中,再放入二氧化碳培養箱進行培養。用此法培養的細胞生長良好且易于觀察,適于實驗室研究。但貼壁生長的細胞有接觸抑制的特性,一旦細胞形成單層,生長就會受到抑制,細胞產量有限。如要繼續培養還需將已形成單層的細胞再分散,稀釋后重新接種,然后進行傳代培養。
                      (2)懸浮培養#p#分頁標題#e#
                      少數動物細胞屬于懸浮生長型,這些細胞在離體培養時不需要附著物,懸浮于培養液中即可良好生長,如淋巴細胞和腫瘤細胞。懸浮生長的細胞其培養和傳代都十分簡便。培養時只需將采集到的活體動物組織經分散、過濾、純化、漂洗后,按一定密度接種于適宜培養液中,置于特定的培養條件下即可良好生長。傳代時不需要再分散,只需按比例稀釋后即可繼續培養。此法細胞增殖快、產量高、培養過程簡單,是大規模培養動物細胞的理想模式。但在動物體中只有少數種類的細胞適于懸浮培養。
                      ③ 大規模培養法
                      動物細胞大規模培養技術是在貼壁培養和懸浮培養的基礎上融合了固定化細胞、流式細胞術、填充床、生物反應罐技術以及人工灌流和溫和攪拌系統等技術后發展起來的。始于20 世紀60 年代初Capstick 及其同事為生產FMD 疫苗而對BHK 細胞的研究。其后,隨著生物技術產品倍受世人親睞,動物細胞大規模培養技術也隨之得到了迅猛發展,并形成了幾種比較成熟且有應用價值的大規模培養方法。
                      ① 空心纖維法:空心纖維培養法是Richard kncazek 等在1972 年創建的。**初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性濾膜,外徑約為1/3~3/4mm ,表面具有海綿狀多孔結構,既能使水分子、營養物質和氣體透過,也能使細胞在上面貼附生長。這種培養系統的核心部分是由3~6層這樣的空心纖維組成的,培養時將待培養細胞接種于空心纖維的外腔,培養一段時間后,當細胞密度達到107-107個/ml時逐漸用無血清培養液代替含血清培養液。此時細胞雖不再增殖,但能正常生活并繼續分泌所需的蛋白質或其他生物制品。由于這種培養方法在分離和純化分泌物時很方便,因而在生產激素和單抗時被廣泛應用。并相繼開發出了由硅膠、聚砜、聚丙烯等材料構建的新的空心纖維培養系統。
                      ② 微載體法:微栽體法是Wezel 在1967 年shou先創建的。所采用的微栽體是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固體小珠,其直徑約在50 微米到數百微米之間。培養動物細胞時先將微載體在血清中浸泡一下(可加快細胞與微載體的貼附速度) ,然后將制備好的細胞懸液和微載體混合孵育一段時間,待細胞貼附于微載體上后再轉移**培養液中培養,并借助溫和攪拌系統使細胞隨載體均勻懸浮于培養液中。這樣細胞就能夠在微載體表面迅速生長、增殖,細胞濃度可高達107個/ml 。微載體法是一種完全將貼壁培養和懸浮培養融為一體的培養方法。因而不但能使細胞均勻分布,提高了對培養液和培養空間的利用,而且適于各種細胞的大規模培養,收獲過程簡單,放大生產也很容易。因而是一種比較理想的大規模培養方法。只是此法對微載體的要求較高。
                      ③ 微囊法: 微囊法是美GDamon Biotech 公司創建的一種比較理想的大規模動物細胞培養法。其基本技術是:先將欲培養的動物細胞懸浮于海藻酸鈉溶液中,之后使其通過一種成滴裝置(微囊發生器) 而逐滴滴入CaCl2 溶液中,海藻酸鈉一旦進入CaCl2 溶液后即形成半透膜微囊,從而將細胞封閉在其內。然后再將這種包含有細胞的微囊懸浮于培養液中培養。這樣培養液中的水和營養物質可透過半透膜進入微囊供應給細胞,細胞的代謝物也可透過半透膜被排出,而細胞分泌的大分子物質則被阻留而積累與囊內。當培養一段時間后,在細胞密度達到107/ml時即可分離收集微囊,**后破開微囊就能獲得高度純化的大分子產物。
                      細胞培養工作中,以下幾個方面來預防支原體的污染:
                      ①控制環境污染;
                      ②嚴格實驗操作;
                      ③細胞培養基和器材要保證無菌;
                      ④在細胞培養基中加入適量的抗生素。
                      清除支原體,常用方法有:抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。支原體**有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮;其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用,所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。InvivoGen公司研究開發的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體,不影響細胞本身的代謝,并且用M-Plasmocin處理過的培養細胞,不會重新感染支原體。
                       
                      (四)應 用
                       
                      (1)在生物學基礎研究中的應用
                      離體培養的動物細胞具有培養條件可人為控制且便于觀察檢測的特點,因而可廣泛應用于生物學*域的基礎研究中。在細胞生物學上,動物細胞培養可用于研究動物的正?;虿±砑毎男螒B、生長發育、細胞營養、代謝以及病變等微觀過程。如神經細胞的增殖、突起生長、相互識別、刺激傳遞等機理就是通過進行各種神經細胞的培養才弄清楚的。在遺傳學研究中,除可用培養的動物細胞進行染色體分析外,還可結合細胞融合技術建立細胞遺傳學進行遺傳分析和雜交育種;在胚胎工程中通過體外培養卵母細胞并進行體外受精、胚胎分割和移植已發展成了一種較成熟的技術而應用于家畜的繁殖生產中。另外,分離和培養具有多潛能性的胚胎干細胞,還可用于動物克隆、細胞誘導分化、動物育種的研究,并可作為基因轉移的高效表達載體;在病毒學研究中用培養的動物細胞代替試驗動物做斑點分析,不僅方法簡便、準確、而且重復性好。#p#分頁標題#e#
                      (2)在臨床醫學上的應用
                      shou先,動物細胞培養技術可用于遺傳疾病和先天畸型的產前診斷。目前,人們已經能夠用羊膜穿刺技術獲得脫落于羊水中的胎兒細胞經培養后進行染色體分析或甲胎蛋白檢測即可診斷出胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型,以此可避免先天殘疾兒的誕生?,F在用這種方法已能檢測出幾十種代謝性遺傳缺陷疾病和先天畸型疾病。其次,現在的一些科學研究已能通過染色體對比分析檢測出易患癌癥的病人,以便進行及早的預防和治療。在這方面我G的科學工作者有較突出的研究成果:他們改進了淋巴細胞的培養方法,從而使帶有癌基因的人的染色體表現出明顯高于常人的畸變率,這就從細胞分子水平揭示了癌癥的病理、病因,并為癌癥的早期診斷和預防提供了科學依據。再次,細胞培養還可用于臨床治療。目前已有將正常骨髓細胞經大量培養后植入患造血障礙癥患者體內進行治療的報道。另外,動物細胞培養生產的生物大分子制品也可用于治療某些代謝缺陷疾病。
                      (3)在動物育種上的應用
                      目前,由于細胞培養技術、細胞融合技術、細胞雜交技術以及轉基因技術的創建與相互結合,使得人們能夠在細胞水平操作并改變動物的基因進行遺傳物質的重組。這樣就可以按照人類的需要大幅度地改變生物的遺傳組成,從而使新品種的培育在實驗室中即可完成,可大大縮短育種進程,且使育種工作更加經濟有效。胚胎干細胞的研究成果和克隆羊多莉的問世可以說已為動物遺傳育種開辟了一條新途徑。
                      (4)可用于生產大分子生物制品
                      利用動物細胞大規模培養技術生產大分子生物制品始于上世紀60 年代,當時是為了滿足生產FMD 疫苗的需要。后來隨著大規模培養技術的逐漸成熟和轉基因技術的發展與應用,人們發現利用動物細胞大規模培養技術來生產大分子藥用蛋白比原核細胞表達系統更有優越性。隨著大量**性細胞株的創建,在商業利益的刺激下,動物細胞大規模培養技術也迅速發展起來,并被付之于應用。目前,用動物細胞可生產的生物制品有各類疫苗、干擾素、激素、酶、生長因子、病毒殺蟲劑、單克隆抗體等,其銷售收入已占到世界生物技術產品的一半以上。我們相信,隨著動物細胞培養技術的發展,以后還會有更多的生物制品被開發并用于造福人類。
                       
                       
                       
                       
                       
                      動物細胞培養基的發展及應用
                       
                      (一) 引言
                       
                      近年來,動物細胞培養技術已從單純的實驗操作擴展到生物學研究和商業利用的許多方面,成為廣泛采用的技術手段。許多生物技術科學研究和產品的生產都離不開細胞培養。在細胞培養發展史中,細胞培養
                      基的發展占有很重要的位置。動物細胞培養基是體外細胞培養的重要因素。根據培養基的來源及成分的明確程度,動物細胞培養基的發展大致可分為3個階段:天然培養基階段、合成培養基階段、無血清培養基階段。
                       
                      (二)動物細胞培養基發展及其應用
                       
                      (1) 天然培養基階段 
                      這一階段是動物細胞培養基的**初及摸索階段。此階段早期機械模擬細胞的體內生存環境,直接采用某些組織凝塊,生物性液體和組織提取液等作為組織細胞的培養基為特征。如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液等。據記載,**早進行組織培養的是Roux采用溫生理鹽水培育雞胚組織,使之存活了數月之久。隨之,美G生物學家Harrison在無菌條件下,以淋巴液為培養基成功的在試管中培養了蛙胚神經組織達數周,創立體外培養方法。后期便開始了對維持細胞生長的營養成分的研究,并為合成培養基階段的到來打下了基礎。但當時由于條件所限始終沒有穩定的發展起來。
                      (2) 合成培養基階段
                      合成培養基是根據已知細胞所需物質的種類和數量嚴格配制而成的。研究表明合成培養基由于成分清楚,故可通過改變或調節各種成分的種類、數量和比例,觀察細胞生物特有的反應性變化,測知細胞與外界環境的關系,了解細胞生存條件并可誘導細胞定向分化等。自從發現雞胚組織能在輔加各種氨基酸和多肽Locke溶液中存活一段時間,在含有葡萄糖和麥芽糖的培養液中能存活持久些以來,在隨后時間里人們設計了許多添加各種輔助成分的培養基。常用合成培養基的種類和特點一般是依據條件、經驗和培養基的特點選用。目前常用的是MEMEagle、RPMI1640培養液等。jue大多數細胞的體外培養需要在合成培養基中補充一定量的成分不明確的生物性液體或組織提取液才能支持細胞的生長增殖,其中血清因來源豐富且易于保存而成為被**廣泛采用的培養基添加物,**常用的為小牛血清。小牛血清是由很多大小不同生物分子組成的極為復雜的混合物,對促進細胞生長與抑制生長活性是生理平衡的,它不是一種簡單的液體,它含有各種血漿蛋白質、脂肪、碳水化合物、無機物質等。血清的營養作用是極大的補充營養液配方的成分,但是血清中所含的成分復雜。就蛋白質而言,血清中所含的蛋白成分不少于150種。這就給動物細胞培養造成了諸多不利的因素:①血清非常昂貴,血清的費用占到培養基費用的50%,致使生產成本大幅度提高。② 血清中含有某些不利于細胞生長的毒性物質或抑制物質,對某些細胞的體外培養有去分化作用。③血清中大量成分復雜的蛋白質給疫苗、細胞因子、單克隆抗體等下游培養產物的分離純化帶來很大的困難。④ 批次與批次之間血清質量的差異會影響細胞生長,**終影響產品質量。血清易被支原體和雜質污染。也正是由于血清的應用存在上述問題才促使人們對無血清培養基的研究和應用日益重視。為了多種理由除去血清中的不確定成分,創造一種完全化學成分明確的培養液將是一個具有巨大進展意義的工作。#p#分頁標題#e#
                      (3) 無血清培養基階段 
                      無血清培養基就是在合成培養基的基礎上,引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分,使培養基能滿足動物細胞培養的要求,又可有效的克服因使用血清所引發的問題。由于無血清培養基可以是完全采用已知分子結構和構型組分的低蛋白或無蛋白培養基,因而它不僅為研究和闡明細胞生長、增殖和分化的調節機制提供了有力的工具,而且為現代生物技術尤其是細胞工程的應用準備了更好的條件。1975年,Hayashi等在培養基中用激素代替血清使垂體細胞株Gh3在無血清介質中生長獲得成功,預示著無血清培養基的誘人前景。進入2O世紀80年代后,新的無血清培養基不斷問世,人們經過研究發現,只要在培養基中增加某些適于細胞生長的成分,如纖連蛋白、轉鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等 砌,不少細胞即能在無血清供應的情況下生長口”。尤其是CHO、雜交瘤、骨髓瘤細胞以及BHK細胞等f 51。某些細胞在無血清的條件下,其生長和抗體的產量甚**較有血清培養時高出數倍。另外,動物細胞培養應用無血清培養基的成功,還將為某些疫苗的生產降低成本。這些都足以說明動物細胞無血清培養基的研究和應用進入了新的時期。
                      無血清培養基的優勢:
                      采用無血清培養基培養動物細胞大致有如下好處:①可避免血清批次間的質量變動,提高細胞培養和試驗結果的重復性;②避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染;③避免血清組分對試驗研究的影響;④有利于體外培養細胞的分化;⑤ 可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。
                      雖然有上述這些好處存在,但無血清培養基也并非**無缺。其不足之處主要表現為細胞的適用譜極窄,細胞在無血清培養基中更易受某些機械因素和化學因素的影響以及培養基難以保存等,皆不如傳統的添加小牛血清。
                      無血清培養基的分代:
                      目前,無血清培養基已進入第3代,第l代無血清培養基雖然不合血清,但含有大量的動物和植物蛋白如牛血清白蛋白BSA和動物的刺激激素等,雖然其總蛋白量明顯低于有血清培養基,但蛋白含量依然很高。因此廠商致力于發展第2代無血清培養基,其主要特點是完全不用動物來源蛋白,稱之為無血清,無動物衍生蛋白。它的優點是既可降低生產成本,又能加快報批的速度, 因為政府藥品監管部門對產品是否用含無血清培養基生產相當關注。由于生物工程的要求,第3代無血清培養基近年已出現,即完全沒有蛋白或含量極低,稱之為雙無培養基,即Serum—free,Protein—free培養基。這帶來下述幾個方面的好處:shou先是因為培養基全為化學已知物,因此細胞培養與生產很容易做到恒定;其次是細胞分泌的目標蛋白的分離純化更為容易;**后是細胞培養基的成本(指原材料成本,不包括研究開發費用)大為下降,生產中品質管理更加容易。早期的無血清培養基其兩個主要指標即細胞生長速率和細胞密度都低于有血清培養基,現在的無血清培養基在上述兩個指標包括蛋白分泌量都不亞于血清培養基,甚**更好。目前預測第4代無血清培養基將會進入研究與開發,這將是一種無血清、無蛋白、又可以高溫消毒的適合于許多種不同細胞生長的全能型培養基。
                      無血清培養基的應用:
                      近年的實踐證明,使用無血清培養基在細胞的生長速率和細胞密度及蛋白的表達水平都不亞于血清培養,甚**在某些方面超過血清培養,而這正是評價細胞培養基的幾個重要指標。無血清培養基尚存在不足的方面,但其顯著的優勢將使無血清培養技術逐步取代含血清細胞培養。無血清培養基已廣泛的應用于細胞生物學、藥理學、腫瘤學和細胞工程*域。無血清培養基的應用主要表現在以下幾個方面:①研究細胞的分化條件:目前已有許多在含血清的培養基中不能保持原代細胞分化現象的細胞系,在無血清培養基中成功地保留著分化能力和分化現象。如人結腸癌細胞LIMI1863在無血清培養基的培養下保持著腎臟的轉運功能;②用于激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究;③用于從多種細胞混雜的培養中選擇目的細胞,通過對無血清培養基中的某些成分的取舍,可抑制原代組織培養物中非目的細胞的過度生長,達到選擇目的細胞的目的;④ 腫瘤病理學和病因學的研究:如用于研究致癌因子對細胞的影響,研究腫瘤細胞對可能觸發正常細胞終末分化的外周信號的反應能力,或用于研究正常細胞與腫瘤細胞的生長和移行與基底膜信號的關系等;⑤用于生產疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品。這可以說是無血清培養基**重要的同時也是**有發展前景的應用*域。一方面是由于無血清培養基的成分明確、質量一致、蛋白含量低,因而有利于提高細胞產品生產的穩定性并使細胞產品易于純化;另一方面是可通過對培養基成分的優化,使不同的細胞能各自在**有利其生長或**有利于表達目的產物的環境中持續高密度培養。
                       
                      (三)展望
                       
                      經過幾十年來的研究與實踐應用,大規模動物細胞培養技術已日趨完善。隨著這一技術的進一步發展,人們還將不斷努力設計理想的生物反應器以獲得高密度、高活力的細胞開發新的無血清培養基,使生物制品更安全,建立細胞培養與產物分離的耦合系統,充分利用培養液以降低生產成本等,動物細胞培養技術將在生物制備和基因工程等*域得到更廣泛的應用圈。#p#分頁標題#e#
                      尤其是無血清培養基的發展更為迅速。無血清培養基具有許多傳統的含血清培養基無法比擬的優勢,但還有許多不足之處有待改善。shou先,無血清培養基只能用于一種或少數幾種細胞高密度生長或高水平表達目的產物,缺少通用性,有待于研究具有廣泛適應性的無血清培養基。其次,將無血清培養基與發酵罐培養技術相結合成為一個新的研究熱點,如何將其應用于發酵工程進行大規模生產目的產物將有待于繼續研究與關注。另外,無血清培養基目前還存在成本高的問題,因而降低其成本的方法值得探索。
                       

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