ES 細胞培養

                      ES 細胞培養

                      A.FBS的滅活與分裝
                      1.化凍
                      將血清(Fetal Bovine Serum,Hyclone)從-20℃冰箱取出,放于4℃冰箱化凍過夜;也可室溫(或浸于自來水中)化凍,化凍后若不馬上滅活,可以放入4℃冰箱暫時保存;
                       
                      2.滅活
                       
                      (1) 放入室溫的水浴鍋內開始加熱(同時放入一個內裝200 ml自來水的血清瓶,插入一根溫度計,溫度監控以此為準);
                      (2) 當溫度計顯示56℃時,控制在此溫度30分鐘±3分鐘;若不小心使溫度上升超過56℃,則:若仍未超過60℃,且時間很短(比如:不超過5分鐘),則仍可使用;若超過60℃,或者時間較長,則棄去不用,或者嘗試用于ME細胞的培養;
                      (2) 取出,自然冷卻**室溫(約需1-3小時),可分裝或-20℃繼續凍存;
                       
                      3.分裝
                       
                      (1)轉入細胞間,用移液器將血清分裝,注意預先要將血清輕輕搖動數周、混勻;吹出血清時要注意:不要吹出氣泡(血清很粘稠,很容易產生氣泡;如果已產生氣泡,則在酒精燈火焰上過一下);標好批號和日期;
                      (2)放入-20℃冰箱凍存(分裝一次大約可以使用1—2個月)。
                       
                      B. 配制DMEM血清培養基
                      1.提前**將分裝好的FBS從—20℃冰箱取出,放于4℃冰箱化凍;
                      2.在細胞間中將FBS以及其它需要添加的成分(如,丙酮酸鈉、抗生素等),按照比例加入DMEM培養基中,作好標簽;放入4℃冰箱保存。
                      配制比例如下:
                       

                      50ml體積的干細胞培養液配制

                       

                       

                      DMEM(High glucose)/ DMEM培養基(高糖

                       

                       

                      谷氨酰胺()

                      50ul

                       

                      非必需氨基酸

                      500ul

                       

                      丙酮酸鈉

                      500ul

                       

                      B-巰基乙醇

                      ??

                       

                      雙抗

                      50ul

                       

                      血清

                      7.5ml

                       

                      LIF

                      5ul

                       

                       

                       

                       

                      C.原代胚胎成纖維細胞(ME)的制備
                      1. 取12.5-13.5dpc孕鼠,斷頸處死;
                      2. 將鼠腹面向上放置,70% 酒精潤濕、消毒腹部(防止腹毛飛揚,污染內臟及子宮),剪開皮膚層、肌肉層,打開腹腔,將連接在子宮上的結締組織及脂肪剪去,將子宮取出,轉入無菌10cm平皿中;
                      3. 把平皿轉入超凈臺;
                      4. 用鑷子打開子宮壁,擠出鼠胚,并與胚外組織、胎盤等分離,除去鼠胚的頭、四肢及各種內臟(主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等);
                      5. 將鼠胚移入另一新的無菌皿,用PBS洗三次;
                      6. 棄去PBS,用彎頭剪將鼠胚剪碎,加入PBS洗**溶液基本無色(1-4次);
                      7. 加入適量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520,下同),體積約等于組織塊體積;
                      8. 用滴管輕輕吹勻,室溫下消化1-10分鐘(或消化**溶液渾濁變粘),加入與消化液等體積培養基,輕輕吹打混勻(5-10次),靜置;
                      9. 沉降后將上部溶液輕輕吸出,轉入離心管中。
                      10. 將細胞懸液管離心(1000轉5分鐘);
                      11. 棄去上清,向沉淀中加入適量培養基,輕輕吹打重懸,將其分種**10 cm細胞培養皿,補加適量培養基,作標簽(ME-0;注意:若凍存,則可以使用復蘇后的0代ME制作Feeder;若直接使用則**好不用0代ME細胞做Feeder,要傳到一代以后再用來制作Feeder比較好),轉入培養箱培養;
                      12. 視細胞生長情況換液(一般3天換液一次),若細胞已長滿,則凍存,或者1:3-5傳代(視細胞疏密而定),放入培養箱繼續培養(此后不用再換液);1-5代的ME細胞均可用來制作Feeder。
                       
                      飼養層細胞(Feeder)的制備
                      注:含10 ug/ml絲裂霉素C的DMEM血清培養基(FBS占10%)(實驗室所用MMC為10 mg/mL,Calbiochem)#p#分頁標題#e#
                       
                      1.棄去細胞培養皿中的培養液,加入適量含10ug/ml絲裂霉素C的培養基(DMEM+10% FBS);
                      2. 放入培養箱培養3小時(2-4小時);
                      3. 用0.1% 明膠處理培養皿(將明膠加入,搖動使明膠覆蓋全部皿底,然后吸出明膠棄去即可),室溫放置2小時以上,**皿底明膠干燥為止;
                      4. 棄去含有絲裂霉素C的培養基,加入2-3 mL PBS,輕輕搖動,棄去PBS,如此洗3-5次(必須洗3次以上,以便徹底洗去殘存的絲裂霉素,絲裂霉素是有絲分裂抑制劑,因而對ES細胞有毒性);
                      24. 加入適量胰酶消化30秒,吸去消化液,靜置**細胞層出現裂縫或明顯滑壁為止,加入培養基,吹打,種**明膠處理過的培養皿中即可(如細胞過稀,可再補加絲裂霉素處理過的細胞),半小時后即可使用(如果急用,則可以用ES細胞培養基終止消化,然后與ES細胞一起轉入明膠處理過的新板上),可使用6-10天,用前更換培養液(如未用明膠處理培養皿,則需在培養箱中放置2小時以上方可使用;**好是前**下午制作Feeder,第二天上午使用,這時的Feeder狀態**好,**適于ES細胞貼壁生長,而且萬一制作的Feeder在第二天早上發現出了問題,還可以趕緊補做)。
                       
                      ES細胞培養基
                      DMEM+15%FBS
                      2-巰基乙醇:5.5uM 1000X Gibco 21985-023
                      L-谷氨酰胺:2mM 100X Sigma G8540
                      LIF:1000U/mL 10000X Chemicon ESGRO® (LIF); 10E7 units,貨號:ESG1107
                      非必需氨基酸:100uM 100X Gibco 11140-050
                      雙抗: 100X Gibco 15070-063
                       
                      ES細胞的復蘇
                      1. 提前制備好相應數量的Feeder;
                      2. 準備37-39℃的熱水,從液氮罐中取出所需凍存管(凍存細胞),迅速投入熱水中,迅速劇烈搖動直**凍存液全部融化;
                      3. 轉入無菌間,1000轉/分鐘離心5-10分鐘;
                      4. 棄上清,加入1 ml ES培養液輕輕吹打重懸,轉入鋪有飼養層細胞的培養皿中(凍存前細胞來自多大的培養皿,復蘇時就用相應大小的培養皿),補加適量培養液;
                      5. 轉入培養箱培養,次日換液;此后每24小時換一次液,每48小時傳一次代(視生長情況)。
                       
                      ES細胞的換液
                      1. 提前半小時左右將培養基從4℃冰箱取出,放于室溫(或者放于37℃溫箱內);
                      2. 細胞培養皿從培養箱內取出,相差顯微鏡下作常規觀察(判斷生長情況,并確證未發生污染)后轉入無菌操作臺內;
                      3. 將ES細胞培養皿內的液體吸出、棄去,換新鮮培養基(6 cm培養皿約5 mL,3.5 cm培養皿約3 mL培養基;若死細胞較多則可以先用PBS洗一次,再加培養基);
                      4. 放回培養箱繼續培養。
                       
                      ES細胞的傳代
                      1. 前**下午做好所需數量的Feeder細胞板;
                      2. 提前半小時左右將培養基從4℃冰箱取出,放于室溫(或者放于37℃溫箱內);
                      3. 將ES細胞培養皿、Feeder細胞培養皿從培養箱內取出(相差顯微鏡下作常規觀察,Feeder細胞應生長良好,細胞覆蓋95%左右,**少90%以上的培養皿面積);ES細胞應生長良好,接近長滿培養皿,細胞集落大小一致、疏密均勻,集落形狀規則、呈橢圓形、邊緣光滑、表面光滑,細胞生長致密、核大、胞質少;
                      4. 將ES細胞培養皿內的液體吸出、棄去,用PBS 1 mL左右洗一遍,加入胰蛋白酶溶液,作用約30秒,小心吸出胰蛋白酶溶液,棄去;再作用1—5分鐘,不時觀察,待細胞層(皿底一層白色臟東西樣膜)出現裂縫并明顯開始下滑時,補加培養基,適度吹打(視消化程度及管口粗細而定,**看不到明顯的大的細胞團塊為止);平均分到Feeder培養皿中(滴加,以免將Feeder細胞吹脫落下來),滴加補加培養基**5 ml左右(滴加,以免將Feeder細胞吹脫落下來;若為3.5cm培養皿,則補加**3ml左右),作好標簽;
                      5. 前后左右水平晃動培養皿,使ES細胞均勻分布于培養皿中,放入培養箱繼續培養。
                       
                      ES細胞的凍存
                      1. 常規方法將細胞消化成單細胞懸液;
                      2. 轉入試管,1000轉/分鐘離心5分鐘;
                      3. 配適量凍存液(為含10% 二甲亞砜(DMSO),10% FBS的DMEM培養液);
                      4. 棄上清,每管加入1ml凍存液,吹打成細胞懸液(只要使ES細胞分散成3—5個細胞的小團塊即可),轉入凍存管,作好標簽;
                      5. 放入程序凍存盒內24小時后轉入液氮罐中凍存。
                       

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