細胞培養常見污染


                      細胞污染的類型
                      一、細菌污染
                          細菌污染是實驗室細胞培養中常見的污染。 一開始就要十分重視,防止污染,否則會前功盡棄,不僅浪費時間,而且浪費人力、物力,甚**造成無法彌補的損失。即使在細胞培養液中加入了抗菌素(一般為預防劑量),也可能因為操作不慎而引起污染。**常見的有革蘭氏陽性菌,如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌,其中又以白色葡萄球菌較常見。
                          培養細胞受細菌污染后,會出現培養液變混濁,pH改變而呈現黃色。也有的 培養液肉眼觀察無多少改變,只能在鏡下發現菌體才知污染。所以,每天應仔細觀察。污染后細胞發生病理改變,胞內顆粒增多、增粗,**后變圓脫落死亡,造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。一般細菌污染進程很快,大約污染一兩天后肉眼就能顯著觀察到。

                      二、真菌污染
                          真菌污染是細胞培養過程中**常見的一種,尤其在霉雨季節進行細胞培養更易污染。**常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
                          培養細胞受真菌污染后,可見培養液中漂浮著白色或淺黃色的小點,有的散在生長,培養液一般不發生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中,有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間(發生卵圓形物體污染的幾率很大)。個體細小,有增多趨勢。鏡下看時,要將培養瓶用酒精棉球擦干凈,以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后,細胞生長變慢,但**后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

                      三、支原體污染
                          支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的**小微生物,**小直徑0.2μm,一般過濾除菌無法去除它,光鏡下難以看清它的形態結構。開始不易發現,能在偏堿條件(pH7.6~8.0)下生存,對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結構,無細胞壁,中央有電子密度大的密集顆?;蚪z狀的中心囊。
                          培養細胞受支原體污染后,部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢,部分細胞變圓,從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無明顯變化,或略有變化,若不及時處理,還會產生交叉污染。

                      四、病毒污染
                          采用組織細胞培養法生產疫苗,如果沒有除去潛在病毒的組織培養物,會產生病毒污染。目前,從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養,但生產疫苗是不安全的。若二倍體細胞系有SV40或多發瘤病毒,B淋巴細胞含EB病毒,細胞和會發生變異、轉化,形成異倍體的細胞系。因此,潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

                      五、非同種細胞污染
                          由于細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開,操作不當,往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發現猴和鼠類細胞的混合物,ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的,而現在卻認為是HeLa細胞。目前,世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染,致使許多實驗宣告無效。
                          非細胞培養物所造成的化學成分的污染也偶有發生,大多是由于細胞培養所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質所致。


                      污染來源及鑒別
                      一、污染來源
                      細胞培養過程中污染的來源主要有以下幾條途徑:
                      1、不潔的動物組織標本
                      很多動物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統除外),但由于取材時不小心也會有污染的機會。組織本身含有細菌,如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡,也會帶菌,造成細胞污染。
                      2、空氣
                      空氣中含有大量的微生物,如果操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分下,很容易造成污染。另外,凈化工作臺使用過久,濾板未定期更換或長久不更換,濾氣受塵埃堵塞,工作時不帶口罩或外界氣流過強,污染空氣進入操作區,也會導致污染。春夏季南方地區多雨,空氣濕度大,含菌量多,工作不注意也易造成污染。
                      3、清洗消毒
                      培養用物品、材料洗刷不凈,培養用液和器材滅菌不徹底也會引入微生物和有毒物質。
                      4、操作
                      來自操作者的污染主要有以下幾方面:
                      1、器材和溶液使用前未仔細檢查是否污染過,或者是否已經消毒滅菌處理過,或者雖經處理,時隔已久又末重新處理。
                      2、操作者未戴口罩、帽子,呼出氣中排出細菌和支原體。
                      3、培養瓶口未用75%酒精擦和燒灼。
                      4、操作者不當心,動作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品,如手上皮膚和瓶子外壁等。
                      5、細胞傾液時倒出培養瓶或者滴落在超凈臺上,未及時擦凈或者灼燒。
                      6、灼燒的火不夠旺。
                      7、移液管吸取液體時將空氣中的氣流吸入培養瓶中。
                      8、長時間的將離心管放在離心機中,可能由于口沒有完全封閉而造成污染。
                      9、同一根吸管或者放置吸管的離心管長時間使用造成的一管污染多瓶細胞交叉污染。
                      10、操作者操作時大聲說話,來回走動揚起灰塵等。
                      5、血清,市售血清滅菌不徹底,潛在病毒和支原體污染。

                      二、污染的鑒別#p#分頁標題#e#
                      1、細菌、真菌污染的檢測
                      (1)肉眼觀察  細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生,而且增生迅速,若有污染,在48小時內可明顯觀察到。如培養液變混濁,或略加振蕩有很多漂浮物漂起。
                      (2)鏡下觀察  在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮,即為細菌污染。若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。
                      (3)接種觀察  采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種,也可發現是否有污染。
                      2、支原體污染的檢測
                      (1)相差顯微鏡觀察  將細胞接種于事先放置于培養瓶內的支持物(一般用長形蓋玻片),24小時后用清潔塵鑷子從培養瓶中取出支持物,細胞面向上放置于載物片上,再蓋上較大蓋玻片,用相差油鏡觀察;若不用支持物培養法,直接取少許培養液滴在載物片上,再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒,多位于細胞與細胞之間,有時可見類似于布朗運動的表現。應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。
                      (2)熒光染色法觀察  用熒光染料Hoechst33258,此染料能與DNA特異地結合,可使支原體內的DNA著色,然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為:用支持物蓋片培養法將細胞接種在蓋片上,在細胞匯合前(即未長滿前)取出玻片,于碟皿中,用不含酚紅的Hanks液漂洗,1:3醋酸鉀固定10分鐘,再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘,置于蒸餾水漂洗1~2分鐘,向細胞面滴加數滴pH5.5磷酸緩沖液,然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細胞培養液,先離心去除上清液,再加入Hanks液漂洗,離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘,再用生理鹽水漂洗后去上清液,再用Hoechst33258,DAPI或者PI等核染色試劑,染色10分鐘,加入蒸餾水漂洗,離心去上清蒸餾水,加3~5滴pH5.5磷酸緩沖液,稍吹打使沉淀細胞重懸浮,用吸管吸出,滴于載物片上,蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點,散在于細胞周圍或附于細胞表面。
                      (4)電鏡檢測 可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48~72小時,細胞接近匯合前,用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行。需經過固定、包埋、切片后才能進行觀察。詳細方法同細胞形態觀察法。
                      (5)培養檢測  將2.5×109/L細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基(Sigma或北京生物制品所生產的均可),培養14天后觀察肉湯培養有無霧狀沉淀,然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中,再用瓊脂培養基做分離培養,37℃培養3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。
                      培養加熒光核染色是檢測支原體污染的黃金搭檔。


                      污染的預防
                          預防是防止細胞培養過程中發生污染的**好辦法。只有預防工作做在前,才能將發生污染的可能性降到**小程度。在超凈臺中進行細胞培養時,特別注意在進行移液,傾倒液體的操作過程會產生飛沫并沉積在超凈工作臺內物體的表面。超凈工作臺的氣流并不能阻止飛沫的產生,飛沫會隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺不合理的放置、不恰當的維護以及不規范的使用會破壞超凈工作臺氣流的方向導致飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導致超凈工作臺內物品污染的主要因素造成潛在污染的進一步傳播。因此為減少交叉污染的發生,應盡可能減少超凈工作臺內的物品。不同細胞系以及同一個實驗室不同操作者所使用的培養試劑一定要分開使用,如胰酶、培養液等。否則,一個操作者的失誤可能引起所有細胞發生污染。
                      一般預防可從以下幾方面著手:

                      無菌操作基本技術
                      1. 實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。
                      2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流之流通。實驗用品以5% 新潔爾滅擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。
                      3. 小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
                      4. 工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當等級之無菌操作臺(**少Class II)。操作過程中,應避免引起aerosol 之產生,小心毒性藥品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳針頭之傷害等。
                      5. 定期檢測下列項目:
                      5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
                      5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000 小時/HEPA)。#p#分頁標題#e#
                      6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。
                      7.無菌室的徹底消毒
                      1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;
                      2)甲醛熏蒸法:甲醛是一種廣譜滅菌劑菌,其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。


                      常見的污染如下:
                      1、細菌:細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,根據感染細菌的不同,可有不同的外形,培養液一般會渾濁變黃,對細胞生長影響明顯。
                      仔細檢查一下器皿的滅菌情況,是否在高壓滅菌時放氣時間足夠,壓力足夠!尤其是和儲存培養液接觸的移液管等物品,連續兩次污染的話有可能造成儲存液污染,一定要注意!下次使用前檢查一下培養液是否存在渾濁的現象!
                      可在培養液中加相應的抗生素處理

                      2、霉菌:培養液是清亮的,倒置顯微鏡下無雜質,37度孵箱培養2-3天,仍清亮,但出現絮狀雜質,鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物,可看到明顯的菌絲,細胞仍可生長,但時間長之后,細胞的活力狀態變差,用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內,再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?;蛘咴谂囵B箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有細胞暫時轉移,采用過氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。并把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時,使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后,再移入細胞。孵箱應定期清潔(2月左右),尤其在多雨的季節。
                          其它培養箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外燈照。預防霉菌污染,可在培養基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗;但細胞一旦污染,很難挽救,制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補,建議舍棄該污染細胞。,將環境徹底消毒,如果所有細胞都污染,可能是系統污染,檢查一下培養基和器材,如果只是個別污染,可能是操作問題,就要注意操作

                      3、支原體:黑色的,好象多為多形,培養液一般培養液一般會渾濁,原體感染,G內血清很多都沒有做支原體陰性檢測,而支原體是牛血清中**常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后,細胞病變不很明顯,只是慢慢死去。用泰樂菌素,獸用支原體病的藥,但可用于細胞培養,無任何不良反應。Sigma公司的使用時用50ug/ml Tylosin培養液培養6天或連續傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。

                      4、黑蛟蟲:可以穿透濾膜,也可以通過空氣傳播,低倍下為黑色點狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,培養液也是不渾的,一般不會太影響,細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態良好,且觀測到的運動物無明顯增多,且培養液顏色、透明度無明顯變化,可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象。對細胞生長狀態不會有明顯影響,在細胞增殖旺盛之后會自然消失,除更換血清外無須特殊處理。建議如果細胞有可能是此種污染的話,可以增加細胞的種板密度,以提高細胞的生存率。

                      5、真菌:一般培養液清亮,不變色,鏡下有絲狀物,有些真菌開始很像死細胞碎片,只是它很多很多的小塊很清楚,象珊瑚狀,不象細胞碎片分不清,慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢,不象細菌那么容易被發現,但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了,也很難救活了。

                      6、原蟲:培養液可輕微渾濁,顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多,輕微活動,細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,而且細胞狀態不好,邊緣不清楚,細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這種共生是非常普遍的,但他們的數量小,細胞站優勢所以不會影響到細胞的正常生長,只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長,**終形成惡性循環。


                      污染的清除
                         培養細胞一經污染,多數較難處理。如果污染細胞價值不大,宜棄之;在尋找原因后徹底消毒操作室,復蘇或重新購置細胞,再培養。若污染細胞價值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。
                      一、細菌和真菌的清除
                        1、使用抗生素,抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。 預防用藥一般用雙抗生素,污染后清除用藥需采用大于常用量5~10倍的沖洗法,于加藥后作用24~48小時,再換常規培養液。此法在污染早期有效。
                      二、支原體的清除
                       ?。?、用MRA處理,用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細胞,每4天換一次液,連續處理15天以確保細胞純潔健康.效果好.
                        2、用清洗純化法清除支原體污染的方法
                        細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌
                        其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低**極限.如結合敏感抗生素的抑殺作用,可達到更好的效果。
                        3、藥物輔助加溫處理,先用藥物處理后,再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時,可殺死支原體,但對細胞有不良影響。
                        4、使用支原體特異性血清,用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經抗血清處理后11天即轉為陰性,并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經濟。#p#分頁標題#e#


                      細胞污染圖片



                      小鼠胃癌細胞的球菌感染圖片(細菌污染)


                      念珠菌污染

                            
                      白色念珠菌污染(倒置鏡)

                         
                      革蘭氏染色陽性


                      革蘭氏陰性菌(洋蔥佰克霍德爾菌)


                      中間長梭形的是正在分裂的念珠菌


                      絲狀菌污染圖片(真菌污染)

                         
                      真菌污染   

                              
                      真菌污染


                      支原體污染圖

                         
                      支原體污染電鏡照片(煎蛋狀)

                         
                      支原體污染電鏡照片(其它形狀)


                      支原體污染電鏡照片(其它形狀)


                      支原體掃描電鏡照片


                      冠狀病毒電鏡圖
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